بیوشیمی

همکاران وبلاگ

جناب آقایان نیما شاهعلیزاده، سید حسن مرتضوی و سامان میرعلی یاری و سرکار خانم ها فهیمه مسلمی، محیا هاشمی، مریم السادات الحسینی، سهیلا رستمی و صدف داودیان، از دانشجویان محترم رشته های پزشکی و علوم آزمایشگاهی در دانشگاه علوم پزشکی اراک تغییرات اساسی در وبلاگ ایجاد نموده اند. مدیریت وبلاگ از زحمات ایشان نهایت تشکر و قدردانی را دارد.

+ نوشته شده در یکشنبه ۱۳۸۸/۱۲/۰۹ ساعت ۱۲ ب.ظ توسط |

تصویر میکروسکوپی یک Coccolithophore

تصویر مقابل صفحات کربنات کلسیم را نشان میدهد که سطح یک کوکولیتوفور را تشکیل میدهند. کوکولیتوفورها در گروه هاپتوفیتها قرار میگیرند که شامل جلبکهای تک یاخته، پروتیست ها و فیتوپلانکتونها است. این تصویر که با میکروسکوپ الکترونی با استفاده از روش اسکنینگ تهیه شده است. رنگها طبیعی نیست و بعدا بصورت مصنوعی به تصویر اضافه شده اند.

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۱۱/۲۸ ساعت ۴ ب.ظ توسط |

اسلایدهای آموزشی

بیوتکنولوژی و بیوشیمی پروژه تولید لیزین

رشته پزشکی

رشته علوم آزمایشگاهی

رشته پرستاری

دانشگاه های علوم پزشکی

انیمیشن های آموزشی

مسیرهای متابولیک همراه با مدلهای سه بعدی

کتاب مفاهیم بیوشیمی تالیف James K. Hardy

کلاسهای دانشگاه MIT (بصورت فیلم)

مسیرهای بیوشیمی با فرمت PDF

کلیاتی در زمینه استرس اکسیداتیو

سایت سلول مجازی

شرکتهای ایرانی

شرکتهای خارجی

صد شرکت برتر در زمینه بیوتکنولوژی

"پروژه ژنوم انسان" از زبان Eric Lander

پروفسور دونالد نیکولسون

نقش نانوتکنولوژی در درمان سرطان (بصورت فیلم)

تشخیص HIV

خلاصه مقالات دانشجویان

پروتئینها:

هموگلوبین نرگس فراهانی-علوم آزمایشگاهی

میوگلوبین بهاره احمدی پناه-علوم آزمایشگاهی

بیوسنتز هم وبیماری پورفیری لیلا خدر - علوم آزمایشگاهی

کاتابولیسم حلقه هم و یرقان عاطفه غیاث آبادی - علوم آزمایشگاهی

متابولیسم کربوهیدراتها :

بیماریهای ذخیره ای گلیکوژن جواهر پور محمد - پزشکی ۱۷/۱/۸۸

متابولیسم چربیها:

بیماریهای لیپوپروتئین محمدرضا صفایی-پرستاری ۱۷/۱/۸۸

مسیر پنتوز فسفات مریم نادری-پزشکی

آنزیمها:

مکانیسم عمل آنزیمها زهرا عباسی- علوم آزمایشگاهی

عوامل موثر بر فعالیت آنزیمها بهنوش برادران-علوم آزمایشگاهی

کراتین فسفو کیناز(CPK) ابوذر کرمی-علوم آزمایشگاهی

آمیلاز مریم عالی- علوم آزمایشگاهی

ویتامین ها:

ـویتامینهای محلول در آب:

B₁تیامین رویا سهرابی - پرستاری

اسید فولیک ستاره قربانی- پرستاری

پیریدوکسین(B₆) حکیمه عباسپور-پرستاری ۱۷/۱/۸۸

پنتاتنیک اسید(B₅ )عاطفه عابدی مقدم-پرستاری ۱۷/۱/۸۸

ویتامین C ناهید لسانی - پرستاری ۱۷/۱/۸۸

ـویتامینهای محلول در چربی:

ویتامین K لیلا محبی - پرستاری

ویتامین A سمیرا مهدوی پارسا-پرستاری ۱۷/۱/۸۸

ویتامین D راضیه ابراهیمی-پرستاری ۱۷/۱/۸۸

بیولوژی ملکولی:

سنتز پروتئین سمانه خیراب-پزشکی ۱۷/۱/۸۸

اختلالات اسید و باز:

اختلالات اسید وباز معصومه جعفری-پرستاری ۱۷/۱/۸۸ Normal 0 false false false EN-US X-NONE AR-SA MicrosoftInternetExplorer4 ویتامین Aسمیرا مهدوی پارسا- پرستاری

ویتامین D راضیه ابراهیمی-پرستاری

متابولیسم کربوهیدراتها:

چرخه کربس مرتضی سعیدی-علوم آزمایشگاهی

گلوکونئوژنز مریم فتح آبادی - علوم آزمایشگاهی

متابولیسم لیپیدها:

سنتز اسیدهای چرب فرزانه فریدونی-علوم آزمایشگاهی

چربی های غیرصابونی شونده فاطمه سادات کرماجانی-علوم آزمایشگاهی

سنتز کلسترول نسرین فلاحی-علوم آزمایشگاهی ا

املاح صفراوی هاجر فانی -علوم آزمایشگاهی

اسیدهای نوکلئیک:

نوکلئوتیدها رخساره کیانی فر - علوم آزمایشگاهی

DNA زینب حمزه لو-علوم آزمایشگاهی

RNA عاطفه ترابی-مامایی

RNA ثریا مظفری-علوم آزمایشگاهی

هورمون ها:

مکانیسم عمل هورمون ها عاطفه پوینده -پزشکی

هیپوتالاموس عاطفه پوینده-پزشکی

هیپوفیز داود افریده-پزشکی

هورمون رشد داود افریده-پزشکی

هورمون های گلیکوپروتئینی هیپوفیز قدامی راضیه رجبی-پزشکی

غده تیروئید مجید صمدی-پزشکی

هورمون محرک هورمون رشد مریم ملکی نورعینی-علوم آزمایشگاهی

بخش قشری غده فوق کلیه مینا ماهوری- پزشکی

بخش مرکزی غده فوق کلیه فرناز بقایی-پزشکی

هورمون پاراتورمون مهدیه سادات مدینه بناب-پزشکی

هورمون لوتئینی کننده غده پانکراس مازیار راجعی-پزشکی

تکنیکهای آزمایشگاهی:

PCR:در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. ادامه مطلب

Real-Time PCR : این تکنیک کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات دارد. در این روش میتوان یک سکانس خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونهای مورد مطالعه اندازه گیری نمود. در این تکنیک نیز اصول کلی PCR حاکم است ولی نکته حائز اهمیت این است که پس از تکثیر DNA در هر سیکل، غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود. ادامه مطلب

پایگاه های اطلاع رسانی در اینترنت: در سالهای اخیر پیشرفتهای وسیعی در روشهای اطلاع رسانی، حاصل شده است. مخصوصا در زمینه های نرم افزاری و اینترنت. وجود پایگاه های اطلاعاتی تخصصی، دسترسی به منابع علمی را تسهیل نموده است.ادامه مطلب

DNA microarray:در اين روش، يك زنجيره DNA با توالي دلخواه طراحي و رشته مكمل آن نيز ساخته و پس از فعال شدن بر روي نانوذرات طلا نشانده مي شود. همچنين رشته DNA ديگري كه مكمل بخشي از DNA هدف است پس از فعال شدن روي نانوذره طلا تثبيت مي شوند.ادامه مطلب مهندسی ژنتیک: مهندسی ژنتیک، به مجموعه روشهایی گفته می شود که به منظور جداسازی، خالص سازی، وارد کردن و بیان یک ژن خاص در یک میزبان بکار می‌رود و نهایتا منجر به بروز یک صفت خاص و یا تولید محصول مورد نظر در جاندار میزبان می‌شود. این علم کاربردهای زیادی در علوم پایه، تولیدات صنعتی، کشاورزی و علوم پزشکی دارد.ادامه مطلب بیوتکنولوژی: واژه بیوتکنولوژی نخستین بار در سال ۱۹۱۹ از سوی Karl Ereky به مفهوم کاربرد علوم زیستی در فناوری‌های ساخت بشر به کار برده شد. به طور کلی هر گونه کنش هوشمندانه بشر در آفرینش، بهبود و عرضه فرآورده‎های گوناگون با استفاده از جانداران، به ویژه از طریق دستکاری آن‌ها در سطح مولکولی در بیوتکنولوژی، قرار می‌‌گیرد.ادامه مطلب

Recombinant DNA: نوعی DNA است که بطور طبیعی وجود ندارد و با متصل کردن قطعات DNAی مختلف بدست می آید. بدین منظور توالی DNAی مورد نظر به یک حامل متصل میشود. این حامل ممکن است ژنوم باکتری، یک پلاسمید یا ژنوم یک ویروس باشد.ادامه مطلب RNAi: سیستمی در موجودات زنده است که میزان و نحوه فعالیت ژنها را کنترل میکند. دو نوع RNAی کوچک در این فرآیند نقش دارند: miRNA و siRNA. این بیومولکولها قادر به اتصال به RNA های خاص دیگری هستند و فعالیت آنها را افزایش یا کاهش میدهند.ادامه مطلب

Chemiluminescence: کمی لومینسانس عبارتست از تشعشع نور و مقدار مشخصی از حرارت، در طی یک فرآیند شیمیایی:[A] + [B] → [◊] → [Products] + lightبعنوان مثال واکنش لومینول با پراکسید هیدروژن در حضور کاتالیزور مناسب:luminol + H2O2 → 3-APA[◊] → 3-APA + lightدر طی این فرآیند، آمینوفتالات تولید میشود که یک مولکول فعال است.ادامه مطلب نانوتکنولوژی: فناوری نانو یا نانوتکنولوژی، شاخه ای از دانشهای کاربردی و فناوری است که موضوعات گسترده‌ای را پوشش می‌دهد. موضوع اصلی آن نیز مهار ماده یا دستگاه‌ها در ابعاد کمتر از یک میکرومتر، معمولاً حدود ۱ تا ۱۰۰ نانومتر است.ادامه مطلب

بلاتینگ: در بیولوژی مولکولی و ژنتیک، روش بلاتینگ عباتست از انتقال پروتئین، DNA یا RNA به یک پایه خاص نظیر نیتروسلولز، نایلون یا PVDF. در بسیاری از تحقیقات، این روش پس از الکتروفورز مورد استفاده قرار میگیرد. با تکنیک بلاتینگ، مولکولها از ژل به پایه مورد نظر منتقل میشوند. ادامه مطلب

فلوریمتری: فلورسانس اسپکتروسکوپی (اسپکتروفلوریمتری یا فلوریمتری) نوعی اسپکتروسکوپی الکترومغناطیسی است که خاصیت فلورسانس را در نمونه های مورد مطالعه، بررسی مینماید. در این تکنیک از یک اشعه نورانی با شدت مشخص، برای تحریک الکترونها استفاده میشود. در نتیجه الکترونها به سطوح بالاتر انرژی منتقل میشوند.ادامه مطلب اسپکتروفتومتری: در روشهاي اسپکتروفتومتری (طيف سنجي)، تاثیر محلولها بر امواج الكترومغناطيسي مورد مطالعه قرار میگیرد. محدوده طيف الكترومغناطيس میتواند از اشعه ماوراء بنفش تا امواج راديويي باشد.مقدار نور جذب شده توسط محلول، تابع قوانين Beer وLambert است و از رابطه A=e lc محاسبه مي شود.ادامه مطلب فلیم فتومتری: فلیم به معنی شعله می باشد. اتمهای هر عنصر در اثر تحریک با انرژی حرارتی رنگ خاصي را در شعله ايجاد مي کنند. يعني طول موج خاصي ايجاد مي کنند که رنگ حاصل شده نيز ناشي از آن است. دستگاه فيلم فوتومتر نيز که يکي از ابزارهاي مهم آزمايشگاه هاي پزشکي است، بر همين اساس ايجاد شده است.ادامه مطلب

کروماتوگرافی: کروماتوگرافی (chromatoghraphy) ، در زبان یونانی متشکل از کلمات chroma یعنی رنگ و grophein یعنی نوشتن است. اولین روش‌ کروماتوگرافی در سال 1903 بوسیله میخائیل سوئت ابداع و نامگذاری شد. او از این روش برای جداسازی مواد رنگی استفاده کرد. مارتین و سینج در سال 1952 به پاس اکتشافاتشان در زمینه کروماتوگرافی جایزه نوبل دریافت کردند.ادامه مطلب

الکتروفورز: به سبب اینکه بسیاری از ماکرومولکول های زیستی باردار هستند، می‌توان با استفاده از یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. روش های الکتروفورز مختلفی، برای تفکیک و مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است.ادامه مطلب سانتریفیوژ: روش سانتریفیوژ بر اساس نيروي گريز از مركز است. هر گاه جسمي با سرعت معيني حول يك محور دوران كند نيروئي در جسم متحرك و در جهت مماس بر مسير دوران و به سمت خارج از مركز ايجاد مي گردد كه به نيروي فراگريز يا گريز از مركز موسوم است و مقدار آن از رابطه F=MRW2 بدست می آید.ادامه مطلب

ELISA: روش الایزا (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) یا ایمونوآسی، یک تکنیک بیوشیمیایی است که در تحقیقات ایمونولوژی به منظور بررسی وجود یک آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه های بیولوژیک مورد استفاده قرار میگیرد. الایزا یک روش تشخیصی مهم در پزشکی و پاتولوژی گیاهی محسوب میشود. همچنین از روش الایزا در بخش کنترل کیفیت در بسیاری از صنایع استفاده میشود.ادامه مطلب استخراج و تخلیص پروتئین: خالص سازی پروتئین شامل یک سری مراحل میباشد که برای مجزا کردن یک نوع پروتئین از پروتئین‌های مختلط استفاده میشود. خالص سازی امری حیاتی برای توصیف وظیفه، ساختار و فعل و انفعالات پروتئین مورد نظر میباشد. این کار معمولا با یک نمونه بافت و یا کشت میکروبی آغاز میشود.ادامه مطلب کنترل کیفیت: در مهندسی و تولید صنعتی، بخش کنترل کیفیت و مهندسی کیفیت به بخشی گفته می‌شود که به اصلاح روشهای تولید میپردازد، بگونه ای که کالاها از نظر مرغوبیت و رفع نیازهای مشتری ارتقاء یابند. روش‌های کنترل کیفی معمولاً با همکاری رشته‌های مهندسی و بازرگانی اجراء می‌شوند. ادامه مطلب

Normal 0 false false false EN-US X-NONE AR-SA MicrosoftInternetExplorer4

+ نوشته شده در سه شنبه ۱۳۸۸/۰۷/۲۱ ساعت ۷ ق.ظ توسط |

آزمایشات DNA برای بررسی علت مرگ توتانخامون

پس از سه سال آزمایشات DNA و سی تی اسکن بر روی جسد مومیائی توتانخامون، علت مرگ وی مشخص گردید. بر اساس این آزمایشات مشخص شد که وی از عوارض ناشی از شکستگی پا رنج میبرده است که پس از ابتلا به مالاریا، این عوارض تشدید شده و نهایتا منجر به مرگ وی گردیده است. با این کشف به بحث های فراوان در مورد علت مرگ این فرعون مصر پایان داده شد. اخبار مربوط به این کشف علمی چهارشنبه گذشته در مجله انجمن پزشکی آمریکا (JAMA) منتشر گردید. در این تحقیقات همچنین مشخص شد که توتانخامون از سندرم مارفان نیز رنج میبرده است. سندرم مارفان نوعی اختلال در بافت پیوندی است. همچنین به نظر میرسد که وی مبتلا به بیماری کهلر(Kohler's disease) هم بوده است. در این بیماری جریان خون به پاها کاهش یافته و بتدریج استخوانهای پا تحلیل میرود. توتانخامون در 3300 سال قبل مبزیست. وی در سن ده سالگی فرعون مصر گردید و مرگ وی در 19 سالگی بوده است بدین ترتیب حکومت وی 9 سال بطول انجامید. توتانخامون تحت تعالیم حضرت یوسف، به خدای یکتا ایمان آورد. توتانخامون مردم مصر باستان را از پرستش خدایان متعدد منع کرد و یکتاپرستی را برای آنها برگزید.

برای مطالعه متن کامل مقاله در مجله JAMA اینجا را کلیک فرمائید.

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

پیوندهای وبلاگ

انجمن بیوشیمی جمهوری اسلامی ایران

انستیتو پاستور ایران

سازمان نظام پزشکی جمهوری اسلامی ایران

سازمان انتقال خون ایران

پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

ویکی پدیا

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

Carol Greider

کارول گریدر متولد ۱۵ آوریل ۱۹۶۱ و استاد دانشگاه جان هاپکینز که در سال جاری موفق به دریافت جایزه نوبل پزشکی شده است. تحقیقات وی در مورد تلومرها و تلومراز بوده است.

آنزیم تلومراز در مراحل تقسیم سلول و حفاظت از کروموزومها نقش مهمی دارد برای اطلاعات بیشتر در سایت ویکی پدیا اینجا را کلیک کنید.

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

Jack William Szostak

جک ویلیام زوستاک متولد نهم نوامبر ۱۹۵۲ در لندن و استاد دانشگاه هاروارد که در سال جاری موفق به دریافت جایزه نوبل پزشکی شده است. تحقیقات وی در زمینه نقش تلومرها و تلومراز بوده است.

تحقیقات نشانداده است که آنزیم تلومراز نقش مهمی در مطالعه مکانیسمهای سرطان دارد. جهت اطلاعات بیشتر در مجله نیچر اینجا را کلیک کنید.

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

آنزیم تلومراز

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

تلومراز و سرطان

+ نوشته شده در چهارشنبه ۱۳۸۸/۰۷/۱۵ ساعت ۱۱ ق.ظ توسط |

PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)

در بیولوژی مولکولی، واکنش زنجیره ای پلی مراز یا PCR، بمنظور تکثیر یک قطعه DNA مورد استفاده قرار میگیرد. تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس (Kary Mullis) ارائه شده است. در این تکنیک، یک مولکول DNA میلیونها بار تکثیر میشود. در روش PCR سیکل های دمایی (Cycle) ایجاد میشود. در ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA، دو رشته DNA از هم جدا میشوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده، عمل همانند سازی (Replication) را انجام میدهد. DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA)، رشته الگو(DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد. پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه َ3 در مولکول DNAی مورد نظر هستند. بنابر این بطور اختصاصی فقط به این مولکولها متصل شوند. چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل میشود، در نتیجه فقط مولکول DNAی هدف همانند سازی و تکثیر میگردد. با اعمال تغییرات دمایی بطور متوالی و برنامه ریزی شده، روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر میشود. بنابر این تعداد مولکولهای DNA بصورت تصاعدی و به نسبت ⁿ2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. مثلا یک مولکول DNA، پس از 20 سیکل به 1.047.586 مولکول تکثیر میشود. در مرحله همانند سازی، برای جدا نگهداشتن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. بنابر این از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده میشود. اولین آنزیمی که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Taq polymerase بود که از باکتری ترموس آکواتیکوس(Thermus aquaticus) بدست می آید.

امروزه PCR بعنوان یک ابزار مهم در فعالیتهای تحقیقاتی و بالینی محسوب میشود. بعضی از کاربردهای PCR عبارتند از: کلونینگ DNA بمنظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA (آنالیزعملکردی ژنها)، تشخیص بیماریهای ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی (در تعیین والدین و جرم شناسی) و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال 1993 به پاس ابداع تکنیک PCR، جایزه نوبل به کری مولیس اهداء گردید.

PCR برای تکثیر بخشهای خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار میگیرد. این بخشها ممکن است یک ژن کامل، قسمتی از یک ژن یا سکانسهای بین ژنها باشند. در بسیاری از روشهای PCR، قطعات DNAی هدف حداکثر 10 کیلو جفت باز(kb) دارند. اگرچه در بعضی از روشهای خاص، قطعات بزرگتر حتی تا kb40 را هم میتوان تکثیر کرد. محلول PCR معمولا حاوی مواد زیر است:

1. DNAی الگو: شامل DNAی هدف است که تکثیر میگردد.

2. پرایمرهای Forward و Reverse: به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ3 در یکی از رشته های DNA باشد.

3. Taq polymerase یا DNA پلیمراز دیگری که دمای بهینه اش در حدود 70 درجه سانتیگراد باشد.

4. دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs): مصالح ساختمانی که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند.

5. محلول بافر: شرایط محیطی مناسبی را از نظر pH و یونهای مختلف ایجاد میکند تا پایداری DNA پلیمراز و فعالیت بهینه آن تامین شود.

6. کاتیونهای دو ظرفیتی: یونهای منیزیم یا منگنز

7. کاتیون یک ظرفیتی: یون پتاسیم

محلولPCR معمولا به حجم 10 تا 200 میکرولیتر در لوله های کوچک 0.2 تا 0.5 میلی لیتر تهیه میشود. این لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده مبشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.

در روش PCR تغییرات دمائی(سیکل ها) بین 20 تا 40 بار تکرار میشود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب میشود. دمای لوله ها و فواصل زمانی هم تابع عوامل مختلفی است از جمله: نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها.

مراحل PCR:

1. مرحله شروع (Initialization step): به مدت 1 تا 9 دقیقه دمای محلول به 94 تا 96 درجه (یا 98 درجه اگر پلیمرازها کاملا به حرارت مقاوم باشند) رسانیده میشود. این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن توسط حرارت در روشhot-start PCR هستند.

2. مرحله واسرشت (Denaturation step): این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت 20 تا 30 ثانیه در دمای 94 تا 98 درجه است. در این مرحله بعلت گسستن پیوندهای هیدروژنی (بین نوکلئوتیدها)، DNAی الگو و پرایمرها از هم جدا میشوند و تک رشته های DNA حاصل میگردد.

3. مرحله اتصال (Annealing step): دمای محلول به مدت 20 تا 40 ثانیه به 50 تا 65 درجه کاهش می یابد. در این مرحله پرایمرها به تک رشتهای DNAی الگو متصل میشوند. بطور طبیعی، دمای اتصال (Annealing temperature) در حدود 3 الی 5 درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل میگیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر-الگو، همانند سازی DNA را آغاز میکند.

4. مرحله طویل شدن (Extension/elongation step): دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود 75 الی 80 درجه است که معمولا دمای 72 درجه انتخاب میشود. در این مرحله آنزیمDNA پلیمراز با استفاده از dNTP های موجود در محلول، یک رشته DNAی جدید را در جهت َ5 به َ3 و در مقابل رشته های الگو میسازد.مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه، یک هزار باز را پلیمریزه مینماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه، مقدار DNA در محلول PCR دو برابر میشود. بنابر این در هر سیکل PCR، غلظت DNA بصورت تصاعدی افزایش می یابد.

5. مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation): این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت 5 الی 15 دقیقه در دمای 70 الی 74 درجه انجام میشود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.

6. نگهداری نهایی (Final hold): در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای 4 الی 15 درجه قابل نگهداری است.

7. الکتروفورز در ژل آگارز: نهایتا میتوان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشجص است) الکتروفورز نمود، تا صحت انجام PCR بررسی شود.

کاربردهای PCR

1. تشخیص بیماریها: از روش PCR برای بررسی بسیاری از بیماریها استفاده میشود. مثلا در تشخیص بدخیمی هایی نظیر لوسمی (leukemia) و لنفوم (lymphomas)، سنجش PCR مستقیما بر روی DNAی ژنومی انجام میشود تا تغییر در بیان ژنها بررسی گردد. حساسیت این روش ده هزار برابر روشهای معمول است. PCR را میتوان بمنظور شناسائی میکروارگانیسمهایی بکار برد که قابل کشت نیستند و یا سرعت رشد آنها در محیط کشت خیلی کند است از جمله میکوباکتریها (mycobacteria)، باکتریهای غیر هوازی (anaerobic bacteria) و ویروسها (viruses). در مطالعات میکروبیولوژی از روش PCR برای شناسائی عوامل عفونت زا و تشخیص گونه های پاتوژن از غیر پاتوژن نیز استفاده میشود. بدین منظور ژنهای خاصی رهگیری و تعیین مقدار میشوند. بدلیل حساسیت بالای PCR، میتوان بلافاصله پس از عفونت و قبل از ظهور بیماری، وجود میکروارگانیسمها را بررسی و اقدامات درمانی را آغاز کرد.

2. تحقیقات جنایی (forensic analysis): در صحنه جرم، معمولا مقدار DNA بسیار کم است. بنابر این با روش PCR میتوان تکثیر DNA را انجام داد تا مقادیر کافی از مولکولهای ژنتیکی بدست آید. سپس ماهیت DNA بررسی میشود.

3. انگشت نگاری ژنتیک (genetic fingerprinting): با روش PCR میتوان با توجه به ماهیت DNA به هویت اشخاص پی برد. بعنوان مثال والدین را شناسائی کرد و یا رابطه ژنتیکی افراد را بررسی نمود. همچنین رابطه تکاملی موجودات زنده نیز با روش انگشت نگاری ژنتیکی قابل مطالعه است.

4. بررسی DNA قدیمی (ancient DNA): با روش PCR، مولکولهای DNA بسیار قدیمی حتی متعلق به ده ها هزار سال قبل مورد مطالعه قرار گرفته است. مثلا DNA یک ماموت از چهل هزار سال قبل، مومیایی های مصری و تزار روسیه با این تکنیک بررسی شده است.

5. جداسازی DNAی ژنومی: با روش PCR میتوان بخشهایی از DNAی ژنومی را انتخاب و پس از جداسازی تکثیر نمود. مثلا برای کلونینگ DNA و یا تولید شاخصهای دورگه سازی (hybridization probes) در روشهای Southern و Northern، مقادیر زیادی از DNA مورد نیاز است که با روش PCR قابل تهیه است. همجنین در مواردی که حجم نمونه اولیه بسیار کم باشد، با روش PCR میتوان DNAی موجود را تکثیر کرد و سپس مورد مطالعه قرار داد.

6. تعیین توالی DNA (DNA sequencing): پس از تکثیر DNA با روش PCR، میتوان توالی نوکلئوتیدی را تععیین کرد و در صورت لزوم به پلاسمید باکتری یا DNAی کروموزومی در یوکاریوتها الحاق نمود و بدین ترتیب DNAی نوترکیب (recombinant DNA) ایجاد کرد. حتی در مرحله بعد میتوان سریعا با استفاده از PCR، کلنی های باکتری را از نظر وجود این DNAی نوترکیب مورد بررسی قرار داد.

انواع PCR

با ایجاد تغییراتی در تکنیک PCR، زمینه های کاربرد وسیعی ایجاد شده است. بعضی از انواع PCR بطور خلاصه بشرح زیر است:

1. Allele-specific PCR: بمنظور بررسی تغییر در فقط یک نوکلئوتید (single-nucleotide polymorphisms) در تشخیص بیماریها و کلونینگ DNA بکار میرود.

2. Assembly PCR یا (Polymerase Cycling Assembly:PCA): یک روش آزمایشگاهی برای سنتز مولکولهای DNAی بزرگ است. بدین منظور از الیگونوکلئوتیدهایی استفاده میشود که همپوشانی دارند.

3. Asymmetric PCR: در این روش فقط یکی از دو رشته DNA تکثیر میشود. پلی نوکلئوتیدهای حاصل بمنظور تعیین توالی یا تولید شاخص های دو رگه مورد استفاده قرار میگیرند.

4. Helicase-dependent amplification: در این تکنیک برای جدا کردن دو رشته DNA، بجای حرارت از آنزیم هلیکاز (DNA Helicase) استفاده میشود.

5. Hot-start PCR: برای جلوگیری از تکثیر DNAهای ناخواسته مخصوصا در مراحل اولیه PCR استفاده میشود. بدین منظور قبل از افزودن پلیمراز، دمای محلول به نقطه ذوب (مثلا 95 درجه) رسانده میشود.

6. Intersequence-specific PCR: برای انگشت نگاری DNA از طریق تکثیر مناطق بین سکانسهای تکراری بکار میرود.

7. Inverse PCR: کاربرد این تکنیک زمانی است که فقط یک سکانس داخلی شناسایی شده است.

8. Ligation-mediated PCR: در این روش از DNAهای رابط کوچک (small DNA linkers) که به DNAی مورد نظر متصل شده اند، استفاده میشود. کاربرد این روش در تعیین توالی DNA (DNA sequencing)، genome walking و DNA footprinting است.

9. Methylation-specific PCR: این تکنیک توسط Stephen Baylin وJim Herman در دانشکده پزشکی دانشگاه جان هاپکینز ابداع شده است و بمنظور بررسی متیلاسیون در قطعات CpG (CpG islands) در DNAی ژنومیک بکار میرود.

10. Miniprimer PCR: در این روش از یک نوع پلیمراز جدید بنام(S-Tbr) استفاده میشود که قادر است به پرایمرهای کوچک 9 یا 10 نوکلئوتیدی(smalligos) متصل شود. در حالیکه Taq به پرایمرهای بزرگتری متصل میشود که حدود 20 نوکلئوتید دارند. بنابر این با استفاده از S-Tbr، پرایمرهای کوچکتری را میتوان طراحی کرد.

11. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification: در این روش با استفاده از یک جفت پرایمر، میتوان چند نوع DNAی مختلف را تکثیر کرد.

12. Multiplex-PCR: در این تکنیک از چند پرایمر در یک محلول PCR استفاده میشود و آمپلیکونهایی (amplicons) تهیه میشود که اندازه های متفاوتی دارند و مختص DNAهای مختلفی هستند. با هدف قرار دادن چندین ژن در یک محلول PCR، میتوان با آزمایشات کمتر و زمان کوتاهتر، اطلاعات بیشتری جمع آوری کرد.

13. Nested PCR: در این روش از تکثیر DNAی ناخواسته جلوگیری شده اثرات زمینه ای کم میشود. بدین ترتیب در فرآیند تکثیر DNAی هدف، اختصاصی بودن (specificity) افزایش می یابد.

14. Quantitative PCR : این تکنیک برای بررسی وجود DNA، cDNA یا RNA و همچنین تعیین غلظت آنها یکار میرود. یکی از شاخه های مهم این تکنیک Quantitative real-time PCR است که از نظر صحت (accuracy) در بالاترین سطح قرار دارد و در آزمایشگاه های تشخیص بالینی کاربرد وسیعی یافته است. در روش Q-PCR برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس (نظیر Sybr Green) یا شاخصهای DNAی فلورسانس (نظیر TaqMan) استفاده میشود.

15. RT-PCR: این نوع از PCR بمنظور شناسایی، استخراج یا تکثیر RNA از نمونه های سلول یا بافت مورد استفاده قرار میگیرد. در این تکنیک از ترانس کریپتاز معکوس (reverse transcriptase) برای تبدیل RNA به cDNA استفاده میشود.

16. TAIL-PCR: برای جداسازی سکانس های ناشناخته ای بکار میرود که متصل به یک سکانس شناخته شده اند.

17. Touchdown PCR: یک نوع تغییر یافته از PCR است که موجب کاهش اثرات زمینه ای و غیر اختصاصی میشود. در این روش برنامه PCR به گونه ای طراحی میگردد که در طی سیکل های متوالی، بتدریج دمای مرحله اتصال (Annealing step) کاهش می یابد. بدین ترتیب که در سیکل های ابتدائی، دما در حدود 3 الی 5 درجه بالاتر از Tm پرایمر و در سیکلهای انتهایی در حدود 3 تا 5 درجه پائینتر از Tm پرایمر تنظیم میشود.

18. PAN-AC: در این تکنیک، سلولهای زنده مورد مطالعه قرار میگیرند. به همین دلیل تکثیر DNA در دمای ثابت انجام میشود.

کیتهای PCR

در سایت PrimerDesign کیتهای متعددی برای تشخیص عوامل پاتوژن به روش real-time PCR، به شرح زیر معرفی شده است:

Acinetobacter baumannii

Adenovirus Type B

Adenovirus Type C

Adenovirus Type F and G

Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Aspergillus all pathogenic subtypes

Avian adenovirus: Egg Drop Syndrome

Avian influenza: H5N1

Bacteria Hemorrhagic Septicemia